Bacteria

Taxonomy

Funtional

Bacterial functional profile은 세균 군집이나 세균 유전체를 특정 기능 단위별로 정량화한 프로파일

                Sample 1   Sample 2   Sample 3
KO:K00844          120        35         80
GO:0006096          55        62         41
MetaCyc:GLYCOLYSIS  12.3       8.1       10.4

측정 단위 - 유전자 또는 단백질 family의 abundance - 효소 기능 - 대사 pathway - GO term - DNA 기반 기능 잠재력 - RNA 기반 발현량

생물학적 계층

read / contig
   ▼
gene / protein sequence
   ▼
gene/protein family
   ├─ UniRef
   ├─ KO
   ├─ COG/eggNOG
   ├─ Pfam
   └─ GO annotation
   ▼
enzyme / reaction
   ├─ EC number
   └─ MetaCyc reaction
   ▼
metabolic pathway / module
   ├─ MetaCyc pathway
   ├─ KEGG pathway
   └─ KEGG module

• GO·KO·UniRef : 개별 유전자/단백질 기능 표현
• pathway : 여러 유전자/효소가 구성하는 생화학적 과정

HUMAnN

Link: GitHub

shotgun metagenome 또는 metatranscriptome 데이터로 미생물 군집의 gene family & metabolic pathway abundance를 추정하는 파이프라인

FASTQ
  ▼
MetaPhlAn 종 조성 추정
  ▼
검출된 종의 pangenome에 nucleotide alignment
  ▼
남은 read를 UniRef protein database에 translated alignment
  ▼
UniRef gene-family abundance
  ▼
MetaCyc reaction으로 regroup
  ▼
MetaCyc pathway abundance 추정

taxonomic prescreen 이후 ChocoPhlAn pangenome & UniRef protein family 이용해 기능 추정

출력

genefamilies.tsv

개별 gene family abundance feature : UniRef90/50

UniRef90_A0A123
UniRef90_A0A123|g__Bacteroides.s__Bacteroides_vulgatus
UniRef90_A0A123|unclassified

• UniRef90_A0A123: 군집 전체 abundance

• UniRef90_A0A123|species: 해당 종이 기여한 abundance

• unstratified: 군집 전체

• stratified: taxon별 기여량

Gene-family abundance는 유전자 길이를 보정한 RPK 단위 이후 CPM 또는 relative abundance로 정규화할 수 있다.

의미

Metagenome DNA를 입력했다면:

군집에 해당 gene family가 얼마나 존재하는지를 나타내는 기능적 잠재력

Metatranscriptome RNA를 입력했다면:

해당 gene family의 상대적인 전사 활동에 가까운 값

pathabundance.tsv

MetaCyc pathway의 abundance

PWY-5484: glycolysis II
PWY-5484|g__Bacteroides.s__Bacteroides_caccae

gene family를 MetaCyc reaction에 연결하고 구성 reaction의 abundance와 pathway 구조를 이용해 pathway abundance를 계산한다.

Pathway abundance는 구성 유전자 abundance의 합이 아니다.

Reaction 1 abundance = 100
Reaction 2 abundance = 10
Reaction 3 abundance = 12

pathway abundance는 100에 가까워지는 것이 아니라 필수 반응 중 부족한 부분에 더 크게 제한된다.

군집에 존재할 것으로 추정되는 완전한 pathway의 상대적 양

pathcoverage.tsv

완성도 / 검출 신뢰도 지표

• pathabundance: pathway가 얼마나 많은가
• pathcoverage: pathway 구성요소가 얼마나 충분히 검출되었는가

abundance가 낮아도 coverage가 상대적으로 높을 수 있고 특정 구성 유전자가 많이 검출되어도 pathway 전체 coverage는 낮을 수 있다.

특수 feature

UNMAPPED/READS_UNMAPPED

reference gene/protein에 매핑되지 않은 read

값이 높다면 다음과 같은 가능성 존재

• reference database에 없는 미생물
• 새로운 단백질
• 낮은 품질 read
• 짧거나 보존성이 낮은 서열
• 비암호화 영역
• 바이러스 또는 진핵 DNA
• 데이터베이스 버전 또는 적용 범위 문제

UNINTEGRATED

gene family로 검출되었지만 HUMAnN의 pathway에 통합되지 않은 기능량 pathway에 기여하지 않은 gene abundance

UNMAPPED
= 알려진 gene family에 연결되지 않음

UNINTEGRATED
= gene family에는 연결되었으나 MetaCyc pathway에는 포함되지 않음

KO/GO 관계

UniRef abundance를 다른 기능 체계로 regroup할 수 있다.

UniRef -> KO
UniRef -> GO
UniRef -> EC
UniRef -> Pfam
UniRef -> eggNOG/COG
UniRef -> MetaCyc reaction

humann_regroup_table : UniRef feature들을 KO, GO, EC, Pfam 등의 annotation group으로 합산한다.

이 매핑은 주로 UniRef centroid의 UniProt annotation에서 유도된다. (Galaxy Tool Shed)

UniRef90_A -> K00001
UniRef90_B -> K00001
UniRef90_C -> K00002

abundance(K00001)
= abundance(UniRef90_A) + abundance(UniRef90_B)

UniRef abundance를 KO 단위로 재집계한 것

GO

GO : Gene Ontology

유전자 산물의 기능을 표준화된 용어로 기술하는 계층적 ontology 세 가지 축으로 나뉜다.

GO 범주	의미	예
Molecular Function (MF)	분자가 직접 수행하는 작용	ATP binding, DNA-binding activity
Biological Process (BP)	여러 분자 활동이 참여하는 생물학적 과정	glycolytic process, DNA repair
Cellular Component(CC)	기능이 일어나는 세포 위치|구조	ribosome, membrane, cytoplasm

특징

하나의 유전자 : 여러 GO term

하나의 단백질은 동시에 여러 term을 가질 수 있다.

ATP binding
protein kinase activity
signal transduction
membrane component

계층 구조

좁은 term은 더 넓은 상위 term에 포함된다.

carbohydrate metabolic process
  └─ glucose metabolic process
       └─ glycolytic process

pathway 와 차이점

명시하지 않는 정보 :

• 정확한 반응 순서
• 기질과 생성물
• 반응식
• 화학량론
• 필수 단계
• 대체 경로

기능 분류 | enrichment 분석 적합 대사 pathway reconstruction 부적합

KO

KO : KEGG Orthology

K00844
K00001
K01915

KO : KEGG network 안에서 유사한 기능으로 정의된 functional ortholog group KEGG : KO를 pathway map, module, BRITE hierarchy 등 node로 사용

KO : KEGG에 포함된 기능 단위 | KEGG : 전체 데이터베이스 생태계

의미

서로 다른 생물종에서 동일하거나 매우 유사한 기능을 수행하는 유전자 집단은 무엇인가?

하나의 KO : 특정 효소, transporter subunit, regulator | 복합체 구성요소에 대응할 수 있다.

KEGG 객체	예	의미
KO	K00844	functional ortholog group
PATHWAY	map00010	대사·신호·세포 과정 network
MODULE	M00001	비교적 작은 기능적 단위 | pathway block
REACTION	Rxxxxx	생화학 반응
COMPOUND	Cxxxxx	화합물
BRITE	계층 ID	기능적 분류체계
ENZYME	EC 연계	효소 분류

• KO abundance
• KEGG pathway abundance
• KEGG module completeness
• KEGG BRITE category abundance
• KEGG reaction abundance

장점

• 종 간 비교가 쉬움
• KEGG pathway/module에 직접 연결 가능
• metagenome 기능 프로파일에 널리 사용됨
• 유전자 수준과 pathway 수준의 중간 연결점 역할

한계

• 하나의 KO가 여러 pathway에 참여할 수 있음
• 하나의 반응을 여러 KO가 대체할 수 있음
• ortholog라고 해서 모든 환경에서 기능이 완전히 동일한 것은 아님
• 유전자 위치와 주변 유전자 구조는 표현하지 않음
• abundance만으로 pathway 완성 여부가 보장되지 않음

종합

항목	GO	KO	KEGG pathway/module	HUMAnN pathway
객체 수준	기능 term	ortholog gene group	pathway/network	추정된 MetaCyc pathway abundance
예시 ID	GO:0005524	K00844	map00010, M00001	PWY-5484
개별 유전자 기반	예	예	KO를 통해 연결	gene abundance에서 계산
계층 구조	강함, DAG	BRITE 등과 연결	pathway/module 구조	reaction/pathway 구조
genomic context	없음	없음	없음	거의 없음
abundance 계산	annotation 합산	gene abundance 합산	방법에 따라 다름	HUMAnN 알고리즘으로 추정
주요 용도	기능 분류·enrichment	비교 유전체·대사 기능	시스템·대사 reconstruction	군집 대사 잠재력
주요 한계	term 중복과 계층 의존성	기능과 orthology의 불완전성	pathway 중복·크기 차이	reference 및 inference 의존

Fungi

Taxonomuy

Database

CGF catalog

• 원 논문: A genomic compendium of cultivated human gut fungi (Cell, 2024)
• 원본 코드: https://github.com/yexianingyue/Cultivated-Gut-Fungi

구축 원리와 검출 과정

[배양·시퀀싱] [유전자 예측] [클러스터링] [매핑/정량]
건강한 사람 분변 -> 760 진균 유전체 -> 비중복 유전자 -> 메타지놈 read 를
에서 진균 배양 각 유전체의 유전자 카탈로그(대표 서열) 유전자에 매핑 ->
(CDS) 예측 + 종(species) 연결 종별 상대 풍부도(%)

Curation

1. 배양(culture) : 건강한 사람의 분변에서 진균을 직접 배양한다.
2. 시퀀싱 & 어셈블리 : 배양한 균주를 시퀀싱해 유전체를 조립한다.
3. 규모 :최종적으로 760개 유전체 / 206 species / 48 families 가 모였고, 이 중 69 species 는 기존에 알려지지 않은 신규 종이다.
4. 분류(taxonomy) 부여. 각 유전체를 계통(kingdom->species)에 연결한다. -> db.fungi.taxonomy.tsv,genomes_2_clu.tsv.

유전자 예측과 Clustering

유전자 예측

각 유전체에서 단백질 코딩 유전자(CDS)의 핵산 서열을 예측한다. (원본 예제의 genes/.ffn)

MMseqs2

모든 진균 유전자 핵산 서열을 MMseqs2 로 클러스터링한다 :

mmseqs easy-cluster genes/ database/geneset tmp \
--min-seq-id 0.95 --cov-mode 1 -c 0.9 --cluster-mode 2 \
--cluster-reassign 1 --kmer-per-seq 200 --kmer-per-seq-scale 0.8

• --min-seq-id 0.95 : 서열 유사도 95% 이상이면 같은 클러스터로 묶는다.
• -c 0.9 --cov-mode 1 : 길이 90% 이상이 겹쳐야 묶는다(짧은 우연 일치 방지).
• 결과: 비슷한 유전자들이 하나의 클러스터로 합쳐지고, 각 클러스터에서 대표 서열 1개만 남긴

비중복 유전자 카탈로그(db.fungi.fa.gz)가 된다. -> 매핑 reference 가 가벼워지고 중복 정렬이 줄어든다.

고유(unique) / 공유(shared) 유전자

클러스터마다 "이 유전자가 어느 종에서 왔는가"를 유전체 분류 정보로 되짚는다.

gene -> cluster -> (그 클러스터에 속한 유전자들이 온) 종 목록

- 클러스터가 한 종에만 연결됨 -> 그 종의 고유(특이) 유전자 (정량의 핵심 근거) - 클러스터가 여러 종에 연결됨 -> 공유 유전자 (어느 종인지 단정 불가, 나중에 비례 분배)

결과물: - gene2clu.map : gene -> cluster(들). 콤마면 여러 종에 걸친 공유 클러스터. - clu.uniq_gene.sum : 종별로, 그 종의 고유 유전자 클러스터들의 총 길이 합. -> 길이 정규화에 사용.

유전자가 길수록 read 가 우연히 더 많이 붙는다. 종마다 고유 유전자 총길이가 다르므로, read 수 ÷ 고유 유전자 길이 로 보정해야 종끼리 공정하게 비교된다.

Detection

전처리된 paired-end WMS read 를 받아, 불필요한 read 를 단계적으로 걸러낸 뒤 남은 read 로 종별 상대 풍부도를 계산한다. (read 는 R1/R2 를 묶지 않고 single-end 로 풀링: -U R1,R2 )

필터링

입력 read

│ STEP1 진균 유전자에 붙는 read 만 남김 (--al-gz, db.fungi.fa.gz)

▼

진균 후보 read

│ STEP2 사람(human/PhiX) 유래 제거 (--un-gz) ※기본 skip, 상류 전처리 전제
│ STEP3 세균(UHGG) 유래 제거 (--un-gz)
│ STEP4 rRNA 유래 제거 (--un-gz, db.fungi_target.fa.gz)

▼

깨끗한 진균 read

│ STEP5 진균 유전자에 재매핑, -k 1000 (다중 매핑까지 SAM 으로 확보)

▼

SAM -> GPA.py -> 종별 상대 풍부도(%) (.rc)

• STEP1 에서 먼저 진균만 추리는 이유:

진균 read 가 워낙 적어, 전체에서 바로 정량하면 노이즈에 묻힌다. 진균 유전자에 붙는 read 만 모은 뒤 오염원을 빼는 편이 효율적이고 민감하다.

• 제거 이유: 사람·세균·rRNA 서열은 보존도가 높아 진균 유전자에 우연히 교차 정렬되어 풍부도를 부풀린다. 특히 rRNA 는 다중 복제·고보존이라 반드시 제거한다.

• STEP5 -k 1000:

한 read 가 여러 유전자(여러 종)에 붙는 경우를 빠짐없이 SAM 에 남겨 다음 단계에서 공정하게 분배

풍부도 계산 원리 (Gene/Genome Profiling Abundance)

"확실한 것(고유 유전자에 유일하게 붙은 read)으로 먼저 종 비율을 정하고 애매한 것(여러 종에 붙은 read)은 그 비율대로 나눠 준다."

1. 유사도 필터: 정렬 identity 가 95%(-s 0.95) 미만이면 버린다. (CIGAR 길이 대비 MD:Z 일치 염기 수로 계산)

2. fragment 단위 중복제거: R1/R2 는 같은 read 이름(QNAME)을 공유하므로, 같은 종에 붙은 mate 는 {QNAME}{종} 키로 한 번만 센다 -> 이중 계수 없음(= fragment 단위).

3. 유일 매핑 집계: 한 종의 고유 유전자에만 붙은 read -> 그 종에 직접 카운트.

4. 예비 상대 풍부도: 종별로 유일매핑 read 수 ÷ 그 종의 고유 유전자 총길이.

5. 다중 매핑 재분배: 여러 종에 붙은 read 는 4번에서 구한 종별 비율대로 비례 배분해 더한다.

(후보 종 모두 고유 매핑이 0이면 분배 불가 -> 1.vs.multiple.only 로 따로 집계, 풍부도엔 미반영)

1. 정규화: (유일 + 분배) ÷ 고유 유전자 길이 를 전체 종에 대해 백분율(%) 로 환산.

-> cluster<TAB>percent 2열 TSV(<sample>.rc)로 출력.

대응표

DB	만들어지는 단계	검출에서의 쓰임
760genomes/, .taxonomy.tsv	Curation	종 분류의 원천
db.fungi.fa.gz (비중복 유전자)	Clustering(2-2)	진균 매핑 reference (STEP1·STEP5)
gene2clu.map	Clustering(2-3)	gene->종 연결, 고유/공유 판별(GPA)
clu.uniq_gene.sum	Clustering(2-3)	종별 고유 유전자 길이, 정규화(GPA)
db.fungi_target.fa.gz	(rRNA 등 target)	rRNA read 제거 reference (STEP4)

한계

• 배양 가능한 종만 포함: 배양 기반이라 배양이 안 되는 진균은 빠질 수 있다.

• 고유 유전자 의존: 고유 유전자가 거의 없는 매우 가까운 종들은 분해능이 떨어질 수 있다.